Sonuç Önce:
Öncelikle uygulama alanlarında ve algılama hedeflerinde farklılık gösteren polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanan dört teknik, qPCR, RT-PCR ve RT-qpcr-vardır.
- PCR esas olarak DNA dizilerinin amplifikasyonu ve tespiti için kullanılır.
- QPCR, DNA veya cDNA içeriğinin gerçek zamanlı nicel tespitini sağlar.
- RT-PCR öncelikle RNA moleküllerinin amplifikasyonu ve tespiti için kullanılır.
- RT-QPCR, RNA moleküllerini kantitatif olarak analiz etmek için RT-PCR ve qPCR tekniklerini birleştirir.
▆ I. Standart PCR
Birinci nesil PCR olarak da bilinen standart PCR, bir şablon olarak çift sarmallı DNA'yı ve özellikle çift sarmallı DNA'yı yükseltmek için bir substrat olarak DNTP kullanır. Agaroz jel elektroforezi daha sonra ürünlerin nitel analizi için kullanılır.
PCR işlemi kabaca üç temel aşamaya ayrılabilir: yüksek sıcaklık denatürasyonu (yaklaşık 95 derece), düşük sıcaklık tavlama (55 ve 60 derece arasında) ve orta sıcaklık uzantısı (yaklaşık 72 derece, DNA polimeraz için optimal reaksiyon sıcaklığı).
Birkaç denatürasyon, tavlama ve uzatma döngüsünden sonra, hedef gen milyonlarca kez güçlendirilebilir. Jel elektroforez, amplifiye edilmiş DNA'yı tespit etmek için kullanılabilir (tanımlama ve saflaştırma için moleküler ağırlığına göre DNA'nın ayrılması).
▆ İi. Nicel gerçek zamanlı PCR (qpcr)
Kantitatif gerçek zamanlı PCR, ikinci nesil PCR, PCR amplifikasyon işleminin uzatma aşamasında floresan prob etiketli hedef genlerden gerçek zamanlı floresan sinyalleri toplar. Hedef genin kopya sayısı veya ekspresyon seviyesi, üç parametre arasındaki ilişki yoluyla belirlenir: floresan sinyali, CT değeri ve hedef genin başlangıç konsantrasyonu. Bununla birlikte, mutlak nicel analiz sonuçları CT değerlerine ve standart eğrilere bağlı olduğundan, sözde "nicelik" bir anlamda görecelidir. Ayrıca, algılama duyarlılığı, doğruluğu ve çözünürlüğü, düşük kopya hedef gen şablonu konsantrasyonlarındaki ince farklılık koşulları altında sınırlıdır. QPCR'de yaygın olarak kullanılan iki floresan yöntemi Taqman probu ve Sybr Green'dir.
▆ III. Ters Transkripsiyon PCR (RT-PCR)
Ters transkripsiyon PCR (RT-PCR), bir RNA ipinin tamamlayıcı DNA'ya (RNA'ya bağlı DNA polimeraz veya ters transkriptaz kullanılarak) ters kopyalanmasını içerir; Her döngü daha sonra standart PCR protokollerini takip ederek miktarı iki katına çıkarır. Şablon RNA toplam RNA, mRNA veya in vitro kopyalanan RNA ürünleri olabilir.
▆ IV. Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon PCR (RT-QPCR)
Gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-qpcr), RT-PCR ve qPCR tekniklerini RNA moleküllerini kantitatif olarak analiz etmek için birleştirir. RT-QPCR, gen ekspresyon analizi ve viral yük tespiti gibi RNA ekspresyon seviyesi çalışmalarında yaygın olarak kullanılır.
