BCA Protein Kantitatif Tespit Kiti

Bradford ve BCA yöntemleri, protein konsantrasyonunun kantitatif belirlenmesinde en sık kullanılan yöntemlerdir. BCA Protein Kantitatif Saptama Kiti, toplam proteinin kolorimetrik tespiti ve miktarının belirlenmesi için bisinkoninik asit (BCA) bazlı, deterjanla uyumlu bir formülasyondur. Bu yöntem, alkali bir ortamda protein yoluyla Cu2+'nun Cu+'ya iyi bilinen indirgenmesini (biüre reaksiyonu), bisinkoninik asit içeren benzersiz bir reaktif kullanarak bakır katyonunun (Cu+) oldukça hassas ve seçici kolorimetrik tespitiyle birleştirir. . Bu tahlilin mor renkli reaksiyon ürünü, iki BCA molekülünün bir bakır iyonuyla şelasyonuyla oluşturulur. Bu suda çözünür kompleks, geniş bir çalışma aralığında (50-2000 µg/mL) artan protein konsantrasyonlarıyla neredeyse doğrusal olan 562 nm'de güçlü bir absorbans sergiler.

Bu yöntem, %5 SDS, %5 Triton X-100 ve %5 Tween-20, 60, 80 vb. dahil çoğu numunedeki kimyasal maddelerden ve yüksek deterjan konsantrasyonundan etkilenmez. Ancak şelatlama ajan ve yüksek konsantrasyon azaltıcı ajan tespit sonuçlarını etkileyecektir. Bu nedenle numunede EGTA bulunmadığından, EDTA konsantrasyonunun 10 mM'den az olduğundan, DTT ve -merkaptoetanol konsantrasyonunun 1 mM'den az olduğundan emin olmak gerekir. Numune şelatlayıcı madde veya indirgeyici madde içeriyorsa lütfen Bradford proteini kantitatif tespit kitini (G2001) göz önünde bulundurun.

Oda sıcaklığında gönderin; 2-8 derecede protein standardı (BSA) deposu, 12 ay geçerlidir. Protein standart çözeltisi -20 derecede saklanmalı ve 6 ay içerisinde kullanılmalıdır. Kalan reaktifler 12 ay süreyle geçerli olacak şekilde oda sıcaklığında saklanır.

1. Protein standart depolama solüsyonunun hazırlanması: protein standart tüpüne (BSA) 1 mL protein standart seyreltici solüsyon ekleyin ve 25 mg protein standardı, 25 mg/mL konsantrasyona sahip protein standart depolama solüsyonu elde etmek için tamamen eritilir. Standart protein depolama çözeltisi -20 derecede uzun süre saklanabilir;

2. Protein standardı çalışma çözeltisinin hazırlanması: 25 mg/ml protein standardı depolama çözeltisi, 0,5 mg/ml'lik nihai konsantrasyona sahip protein standardı çalışma çözeltisi elde etmek için PBS veya normal salinle 50 kez seyreltilir. Doğruluğu sağlamak için seyreltme için 10 kat gradyan yöntemine dikkat edin.

3. Standart eğri (Mikroplaka Prosedürü): Protein standardı çalışma solüsyonu 96-kuyu plakasına 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 ve 20'de eklendi. μL ve ardından yukarıdaki degrade çalışma çözümü, 20, 19, 18, 16, 12, 8 eklenerek 20 μL'ye tamamlandı. Aşağıdaki sırayla 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 ve 500 ug/mL protein konsantrasyonlarına sahip gradyan eğrilerini elde etmek için PBS veya fizyolojik salin ile 4 ve 0 μL. Gradyan eğrileri 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ug/mL sırasıyla elde edildi.

4. Test numunesinin hazırlanması: test numunesi uygun şekilde seyreltilir (test öncesi tespit yoluyla test numunesinin protein konsantrasyonu, tespit sonuçlarının güvenilir olmasını sağlamak için standart eğri aralığı dahilindedir) ve 96-kuyu plakalarına her test numunesinden 20 µL pipetleyin. Test numunesi ve protein standardı çalışma solüsyonu aynı solüsyonla seyreltilir.

5. BCA çalışma solüsyonunun hazırlanması: 50 kısım BCA Reaktifinin 1 kısım bakır sülfat solüsyonu (50:1, BCA Reaktifi: bakır sülfat solüsyonu) ile karıştırılması. BCA çalışma solüsyonu oda sıcaklığında saklanabilir ve 24 saat içinde kullanılabilir. Her kuyuya 200 μL BCA çalışma solüsyonu ekleyin. İsrafı önlemek için gerektiği kadar hazırlanması tavsiye edilir.

6. Tespit: her kuyucuğa 200 µL BCA çalışma solüsyonu ekleyin ve plakayı bir plaka çalkalayıcı üzerinde 30 saniye boyunca iyice karıştırın; Kapatma plakası ve 30 dakika boyunca 37 derecede inkübe edildikten sonra, bir plaka okuyucu üzerinde 562 nm'de veya yakınında absorbansı ölçmek için standart eğri No. 0 referans olarak kullanıldı. (Not: Oda sıcaklığında 2 saat veya 60 derecede 30 dakika da reaksiyona sokulabilir. Protein konsantrasyonu düşükse 60 derecede reaksiyona sokulması tavsiye edilir.)

7. Hesaplama: Standart eğri, apsis olarak gradyan protein içeriği (ug/mL) ve ordinat olarak absorpsiyon değeri ile çizildi. Test numunesinin absorbans değerine göre, ilgili kuyucuktaki test numunesinin protein konsantrasyonu (ug/mL) standart eğride bulunabilir ve ardından numunenin seyreltme faktörü ile çarpıldığında gerçek protein elde edilir. test numunesinin konsantrasyonu.

1. BCA yöntemiyle protein konsantrasyonunun belirlenmesi sıcaklık ve zamandan büyük ölçüde etkilenir ve zamanın uzaması veya sıcaklığın artmasıyla absorbans değeri değişecektir. Renk reaksiyonunun süresi ve sıcaklığı doğru bir şekilde kontrol edilemiyorsa, her belirleme için standart bir eğri yapılması önerilir.

2. Protein standart depolama solüsyonu hazırlanırken yeterli çözünmenin sağlanması gerekmektedir. Seyreltme Protein standart çalışma solüsyonu hazırlanırken 10 kat gradyanlı seyreltme önerilir. Hatayı önlemek için bir seferde 50 kez seyreltmeyin.

3. Protein miktarını garanti altına almak amacıyla, aynı tespit koşullarını sağlamak amacıyla numune ekstraksiyonu ve protein standart seyreltme için aynı tampon çözeltisini seçmek daha iyidir. Tamponun arka plan değeri yüksekse diğer yöntemler önerilir.

4. Güvenliğiniz ve sağlığınız için lütfen koruyucu gözlük, eldiven veya koruyucu kıyafet kullanın.

Yalnızca Araştırma Kullanımı İçindir!

Popüler Etiketler: bca proteini kantitatif tespit kiti, Çin bca proteini kantitatif tespit kiti üreticileri, tedarikçiler, fabrika